Duffy CRISPR Activation Plasmid (h): sc-406288-ACT

ACKR1 kodiert das Duffy-Antigen/den Chemokinrezeptor, einen atypischen Chemokinrezeptor, der vor allem auf Erythrozyten und venulären Endothelzellen exprimiert wird und entzündliche Chemokine wie CCL2, CXCL8 und verwandte Liganden bindet. Indem Duffy als Chemokin-Senke und -Transporter wirkt, moduliert es Chemokingradienten, das Leukozyten-Trafficking und den Entzündungsgrundtonus innerhalb des vaskulären Mikromilieus. Unterschiede in der ACKR1-Expression werden häufig als Modell zur Untersuchung der Chemokin-Homöostase, der Endothelbiologie und der Regulation von Oberflächenantigenen auf Erythrozyten genutzt, mit Relevanz für entzündungsassoziierte Phänotypen und hämatologische Merkmale. Diese Funktionen verknüpfen ACKR1 mit umfassenderen immunologischen Signalnetzwerken, die Zellmigration, Zytokin-/Chemokin-Signalgebung und vaskuläre Entzündung steuern.

Duffy Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ACKR1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Duffy Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ACKR1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ACKR1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Duffy-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ACKR1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Duffy-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Duffy-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ACKR1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.