Dok-2 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-405016-ACT

O DOK2 humano codifica a Dok-2, uma proteína adaptadora que se liga (“docking”) a tirosina-quinases ativadas, tanto de receptores quanto não receptoras, para coordenar a sinalização a jusante por meio de seus domínios de homologia à pleckstrina (PH) e de ligação a fosfotirosina (PTB). A Dok-2 é um modulador central de vias de imunorreceptores e de citocinas em células hematopoéticas, ajustando a amplitude do sinal de receptores, como aqueles que ativam quinases da família Src, e influenciando respostas associadas a MAPK e PI3K. Ao montar complexos multiproteicos que afetam cascatas de fosforilação, contribui para o controle da ativação, proliferação e diferenciação celulares. Alterações na expressão de DOK2 ou no equilíbrio de sua sinalização têm sido associadas a respostas imunes desreguladas e a contextos de sinalização relevantes para neoplasias hematológicas, sustentando seu uso como um nó mecanístico em estudos de vias de doença.

Dok-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DOK2 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dok-2 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DOK2 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DOK2, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dok-2. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DOK2 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dok-2 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dok-2 em células tumorais com expressão de DOK2 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.