Dnmt3L CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403892-ACT

Humanes DNMT3L kodiert Dnmt3L, einen katalytisch inaktiven, DNA‑Methyltransferase‑ähnlichen Kofaktor, der an die de‑novo‑Methyltransferasen DNMT3A und DNMT3B bindet und sie stimuliert, um während der Entwicklung DNA‑Methylierungsmuster zu etablieren. Durch das Erkennen unmethylierter Histon‑H3‑Tails und die Förderung chromatinassoziierter Methylierungsaktivität trägt Dnmt3L zur epigenetischen Stilllegung, zum genomischen Imprinting und zur Repression von Transposons bei. Die DNMT3L‑vermittelte Regulation greift in Signalwege des Chromatin‑Remodelings und der transkriptionellen Kontrolle ein, die Zellschicksalsentscheidungen prägen. Eine fehlregulierte de‑novo‑Methylierungsmaschinerie und veränderte, DNMT3L‑abhängige epigenetische Zustände werden häufig im Zusammenhang mit aberranter Genstilllegung und Genominstabilität untersucht, wie sie für Krebs und die Entwicklungs‑Epigenetik relevant sind.

Dnmt3L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen DNMT3L-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Dnmt3L Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des DNMT3L-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der DNMT3L-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Dnmt3L-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native DNMT3L-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Dnmt3L-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Dnmt3L-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem DNMT3L-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.