Plasmide CRISPR d'Activation (m) Dnmt3a: sc-420035-ACT

La Dnmt3a murine code une ADN méthyltransférase de novo qui établit les profils de méthylation des CpG au cours du développement et de l’engagement du destin cellulaire, en façonnant l’accessibilité de la chromatine et des programmes transcriptionnels durables. DNMT3A coopère avec DNMT3B et DNMT1 pour maintenir la mémoire épigénétique, reliant la méthylation de l’ADN aux réseaux de modifications des histones et à la répression transcriptionnelle. Son activité influence la différenciation, l’empreinte génomique et le silençage des transposons, et une dérégulation de la méthylation dépendante de DNMT3A est associée à une spécification altérée des lignages et à une instabilité épigénétique dans des modèles de maladies. Dnmt3a est donc largement étudiée dans les voies qui gouvernent la biologie des cellules souches, la régulation hématopoïétique et le contrôle de l’expression génique dépendant de la méthylation.

Dnmt3a Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Dnmt3a sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dnmt3a Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Dnmt3a dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Dnmt3a, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dnmt3a. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Dnmt3a natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dnmt3a au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dnmt3a dans les cellules tumorales présentant une expression de Dnmt3a silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.