Plasmide CRISPR d'Activation (h2) DNA pol δ 4: sc-408268-ACT-2

Le gène humain POLD4 code la sous-unité 4 de l’ADN polymérase delta (Pol δ4), un composant accessoire de l’holoenzyme Pol δ qui soutient la synthèse fidèle de l’ADN du brin retardé lors de la réplication et contribue à la synthèse de réparation de l’ADN. En tant qu’élément de la machinerie de réplication, POLD4 intervient dans les voies centrales qui régissent la progression de la fourche de réplication, le traitement des fragments d’Okazaki et les points de contrôle de la stabilité du génome, en coordination avec l’activité polymérase dépendante de PCNA. Un déséquilibre des sous-unités de Pol δ ou un stress réplicatif impliquant POLD4 a été associé à une augmentation de la charge mutationnelle et à une instabilité chromosomique, des caractéristiques fréquemment observées dans les cancers et d’autres troubles de la maintenance du génome. L’édition génomique ciblant POLD4 et les essais fonctionnels permettent d’étudier l’assemblage du complexe polymérase, le choix des voies de réplication/réparation et les conséquences cellulaires d’une altération de la fidélité de la synthèse de l’ADN dans des systèmes modèles humains.

DNA pol δ 4 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLD4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol δ 4 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLD4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLD4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol δ 4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLD4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol δ 4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol δ 4 dans les cellules tumorales présentant une expression de POLD4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.