Plasmide CRISPR d'Activation (h) DNA pol β: sc-402861-ACT

POLB code pour la polymérase β de l’ADN (ADN pol β), une enzyme clé de la voie de réparation par excision de base (BER) qui comble les brèches d’un seul nucléotide et participe à la réparation « short-patch » après l’élimination de bases endommagées. L’ADN pol β agit sur les sites de lésions oxydatives et d’alkylation, en coordination avec XRCC1, la ligase III de l’ADN et APE1, afin de maintenir la stabilité du génome pendant la réplication et dans les cellules non proliférantes. Une expression ou une activité altérée de POLB a été associée à une charge mutationnelle accrue, à une instabilité chromosomique et à des réponses anormales aux dommages de l’ADN, observées dans de nombreux types de cancers et dans des modèles de maladies neurodégénératives. En tant que facteur central de la BER, POLB est fréquemment étudié dans le contexte de la signalisation du stress génotoxique, de la réparation associée à la réplication et des mécanismes de résistance aux agents endommageant l’ADN dans des systèmes cellulaires.

DNA pol β Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de POLB sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DNA pol β Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus POLB dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription POLB, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DNA pol β. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus POLB natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DNA pol β au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DNA pol β dans les cellules tumorales présentant une expression de POLB silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.