DNA pol β CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402861-ACT

POLB kodiert die DNA-Polymerase beta (DNA-Pol β), ein Schlüsselenzym des Base-Excision-Repair-(BER)-Signalwegs, das Einzel-Nukleotid-Lücken auffüllt und an der Short-Patch-Reparatur nach der Entfernung geschädigter Basen beteiligt ist. DNA-Pol β wirkt an Stellen oxidativer und alkylierungsbedingter Schäden und koordiniert dabei mit XRCC1, DNA-Ligase III und APE1, um die Genomstabilität während der Replikation sowie in nicht teilenden Zellen aufrechtzuerhalten. Eine veränderte POLB-Expression oder -Aktivität wurde mit erhöhter Mutationslast, chromosomaler Instabilität und aberranten DNA-Schadensantworten in mehreren Krebsarten und Modellen neurodegenerativer Erkrankungen in Verbindung gebracht. Als zentraler BER-Faktor wird POLB häufig im Kontext von Signalwegen bei genotoxischem Stress, replikationsassoziierter Reparatur und Resistenzmechanismen gegenüber DNA-schädigenden Substanzen in zellbasierten Systemen untersucht.

DNA pol β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLB-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DNA pol β Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLB-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLB-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DNA pol β-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLB-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DNA pol β-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DNA pol β-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLB-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.