Plásmido CRISPR de Activación (h) DNA pol α: sc-402762-ACT

POLA1 codifica la subunidad catalítica de la ADN polimerasa alfa humana (ADN pol α), una polimerasa asociada a la primasa esencial para iniciar la replicación del ADN cromosómico al extender los cebadores de ARN–ADN sintetizados en los orígenes de replicación y en la hebra rezagada. Esta actividad sitúa a POLA1 en el núcleo del programa de iniciación de la replicación, coordinándose con el licenciamiento de los orígenes y el ensamblaje del replisoma para sostener la progresión de la fase S y la estabilidad del genoma. La alteración de la función de la ADN pol α puede favorecer el estrés replicativo, cambios en la dinámica de las horquillas de replicación y respuestas posteriores al daño del ADN que convergen con la señalización de puntos de control y las vías de mantenimiento de la cromatina. POLA1 se ha implicado en trastornos relacionados con un metabolismo defectuoso de los ácidos nucleicos y con la señalización inmunitaria, y se estudia con frecuencia en el contexto del control de la proliferación y de la inestabilidad genómica asociada a la replicación.

DNA pol α El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de POLA1 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DNA pol α El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus POLA1 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional POLA1, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DNA pol α. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo POLA1 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DNA pol α en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DNA pol α en células tumorales con expresión de POLA1 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.