DinB CRISPR Activation Plasmid (h): sc-405052-ACT

Das humane POLK-Gen kodiert die DNA-Polymerase Kappa (DinB), eine Translesions-DNA-Polymerase der Y-Familie, die die DNA-Replikation über sperrige Läsionen wie UV-induzierte Photoprodukte und Benzo[a]pyren-Addukte hinweg ermöglicht. Durch die Förderung der Schadens­toleranz während der S-Phase trägt POLK dazu bei, das Fortschreiten der Replikationsgabel aufrechtzuerhalten, und beeinflusst das Mutationsspektrum, wenn der Bypass mit verringerter Genauigkeit erfolgt. POLK wirkt in Netzwerken der DNA-Schadensantwort, die Läsions-Bypass, Polymerasewechsel und postreplikative Reparatur koordinieren, und ist damit mit Genomstabilität und zellulärer Anpassung an Stress verknüpft. Eine fehlregulierte POLK-Aktivität oder veränderte Expression wurde mit Mutagenese und genomischer Instabilität in Zusammenhängen in Verbindung gebracht, die für die Krebsbiologie und Expositions-assoziierte DNA-Schadensmodelle relevant sind.

DinB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen POLK-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

DinB Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des POLK-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der POLK-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen DinB-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native POLK-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von DinB-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des DinB-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem POLK-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.