Plasmide CRISPR d'Activation (h) Deltex-1: sc-404446-ACT

Le gène humain DTX1 code Deltex-1, une ligase E3 de l’ubiquitine qui agit comme un modulateur clé de la signalisation des récepteurs Notch et des programmes transcriptionnels en aval qui gouvernent les décisions de destinée cellulaire, la différenciation et la régulation immunitaire. En contrôlant, de manière dépendante de l’ubiquitine, des composants de la voie Notch, Deltex-1 influence la durée et l’intensité du signal, en interaction avec la protéostase et des réseaux de régulation transcriptionnelle. Une activité altérée de DTX1/Deltex-1 a été associée à une dérégulation de la signalisation Notch dans des contextes pertinents pour la biologie des cellules hématopoïétiques et immunitaires, et elle est fréquemment étudiée dans des modèles de reprogrammation oncogénique des voies de signalisation et de signalisation inflammatoire. Ces propriétés font de DTX1 une cible utile pour des études mécanistiques reliant l’ubiquitination à des phénotypes dépendants de voies de signalisation.

Deltex-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DTX1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Deltex-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DTX1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DTX1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Deltex-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DTX1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Deltex-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Deltex-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de DTX1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.