Plásmido CRISPR de Activación (m) DEC2: sc-429771-ACT

Bhlhe41 codifica DEC2, un factor de transcripción básico hélice-bucle-hélice (bHLH) que se une a motivos E-box y modula redes génicas circadianas y bucles de retroalimentación transcripcional. En el ratón, DEC2 participa en la regulación de la temporización sueño–vigilia, la excitabilidad neuronal y la homeostasis metabólica al interactuar con componentes centrales del reloj y controlar la transcripción rítmica aguas abajo. La proteína también influye en programas transcripcionales asociados al linaje, vinculando señales ambientales con transiciones del estado celular. La alteración de la actividad de DEC2 se ha asociado con fenotipos de duración del sueño y con una disrregulación más amplia de vías controladas por el ritmo circadiano relevantes para la neurobiología y el metabolismo sistémico.

DEC2 El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Bhlhe41 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DEC2 El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Bhlhe41 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Bhlhe41, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DEC2. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Bhlhe41 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DEC2 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DEC2 en células tumorales con expresión de Bhlhe41 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.