DDX29 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405089-ACT

DHX29 (DDX29) codifica un fattore umano simile a un’elicasi dell’RNA della famiglia DEAH-box, implicato nell’inizio della traduzione, dove favorisce una scansione ribosomiale efficiente e la selezione del codone di avvio su mRNA strutturati. Modulando il comportamento del complesso di pre-inizio 43S, DDX29 contribuisce all’omeostasi del proteoma e può influenzare programmi cellulari di adattamento allo stress collegati al metabolismo dell’RNA. La perturbazione dei fattori di inizio della traduzione e delle reti di elicasi dell’RNA è frequentemente associata ad alterazioni del controllo della crescita e delle risposte allo stress proteotossico, rendendo DHX29 un nodo rilevante per studi meccanicistici nella riprogrammazione traduzionale associata a malattia. La biologia di DHX29 è inoltre di interesse in contesti in cui cambiamenti nella struttura dell’mRNA o nell’efficienza di inizio rimodellano l’espressione di regolatori coinvolti nel ciclo cellulare, nella differenziazione e nelle vie di risposta allo stress.

DDX29 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DHX29 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDX29 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DHX29 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DHX29, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDX29. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DHX29 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDX29 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDX29 nelle cellule tumorali con espressione di DHX29 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.