Plásmido CRISPR de Activación (h) DDX29: sc-405089-ACT

DHX29 (DDX29) codifica un factor humano tipo helicasa de ARN de la familia DEAH implicado en el inicio de la traducción, donde favorece un escaneo ribosomal eficiente y la selección del codón de inicio en ARNm con estructuras secundarias. Al modular el comportamiento del complejo de preiniciación 43S, DDX29 contribuye a la homeostasis del proteoma y puede influir en programas de adaptación al estrés celular acoplados al metabolismo del ARN. La alteración de los factores de inicio de la traducción y de las redes de helicasas de ARN se asocia con frecuencia a cambios en el control del crecimiento y en las respuestas al estrés proteotóxico, lo que convierte a DHX29 en un nodo relevante para estudios mecanísticos sobre la reprogramación traduccional asociada a enfermedad. La biología de DHX29 también es de interés en contextos en los que los cambios en la estructura del ARNm o en la eficiencia de iniciación remodelan la expresión de reguladores de las vías del ciclo celular, la diferenciación y la respuesta al estrés.

DDX29 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de DHX29 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

DDX29 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus DHX29 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional DHX29, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de DDX29. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo DHX29 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de DDX29 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía DDX29 en células tumorales con expresión de DHX29 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.