Plasmide CRISPR d'Activation (h) DAP10: sc-402426-ACT

HCST code la protéine d’activation DNAX 10 (DAP10), un adaptateur transmembranaire qui couple NKG2D et des récepteurs apparentés à la signalisation intracellulaire dans les lymphocytes cytotoxiques humains. Grâce à son motif YINM, DAP10 recrute PI3K et Grb2/Vav1 afin de favoriser l’activation des voies Akt et MAPK, soutenant la formation de la synapse immunologique, la production de cytokines et la cytotoxicité à médiation cellulaire. Cet axe de signalisation régule la surveillance exercée par les cellules NK et les lymphocytes T CD8⁺ sur les cellules stressées, infectées ou transformées, et influence le dialogue inflammatoire au sein du microenvironnement tumoral. Une activité dérégulée de HCST/DAP10 a été associée à des altérations des réponses immunitaires innées et adaptatives pertinentes pour l’immunobiologie du cancer, l’infection virale et l’inflammation auto-immune.

DAP10 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de HCST sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

DAP10 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus HCST dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription HCST, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de DAP10. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus HCST natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de DAP10 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie DAP10 dans les cellules tumorales présentant une expression de HCST silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.