Plásmido CRISPR de Activación (h) Cytokeratin 3: sc-402161-ACT

KRT3 codifica la citoqueratina 3, una proteína de filamento intermedio tipo II que se asocia con la queratina 12 para formar la red citoesquelética central de las células epiteliales corneales diferenciadas. La citoqueratina 3 contribuye a la estabilidad mecánica, la forma celular y la resistencia al estrés por cizallamiento al integrarse en el ensamblaje de los filamentos intermedios y coordinarse con estructuras asociadas a desmosomas y hemidesmosomas. Su expresión refleja programas de maduración epitelial y se vincula a procesos como el mantenimiento de la barrera, la reparación de heridas y la remodelación epitelial. Los patrones desregulados de expresión de queratinas, incluida la alteración de KRT3, se utilizan para estudiar los estados de diferenciación del epitelio corneal y la patología de la superficie ocular en modelos experimentales.

Cytokeratin 3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KRT3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cytokeratin 3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KRT3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KRT3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cytokeratin 3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KRT3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cytokeratin 3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cytokeratin 3 en células tumorales con expresión de KRT3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.