Plásmido CRISPR de Activación (h) Cytokeratin 14: sc-400362-ACT

KRT14 codifica la citoqueratina 14, una proteína de filamento intermedio de tipo I que forma heterodímeros con la queratina 5 para constituir la red de queratinas basales en epitelios estratificados. Este armazón citoesquelético aporta resistencia mecánica, adhesión célula–célula y diferenciación epitelial, y se conecta con nodos de señalización como los complejos integrina/hemidesmosoma y las respuestas al estrés reguladas por el citoesqueleto. La alteración de la expresión o la función de KRT14 se asocia con fenotipos de fragilidad epidérmica y queratinización desregulada, y se utiliza con frecuencia como marcador de estados epiteliales tipo basal en piel y tejidos glandulares. En biología del cáncer y en modelos de remodelación tisular, los programas asociados a KRT14 se estudian en relación con la plasticidad epitelial, fenotipos vinculados a la invasión y la adaptación al estrés del microambiente.

Cytokeratin 14 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de KRT14 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

Cytokeratin 14 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus KRT14 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional KRT14, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de Cytokeratin 14. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo KRT14 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de Cytokeratin 14 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía Cytokeratin 14 en células tumorales con expresión de KRT14 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.