Plasmide CRISPR d'Activation (h) Cystinosin: sc-405040-ACT

CTNS code la cystinosine, un transporteur membranaire lysosomal qui assure l’efflux de la cystine de la lumière lysosomale vers le cytosol, contribuant au maintien de l’équilibre redox intracellulaire et de l’homéostasie des acides aminés. En régulant l’élimination de la cystine dans les lysosomes, la cystinosine relie la fonction lysosomale à des processus métaboliques plus larges, notamment la dynamique autophagie‑lysosome et les réponses au stress cellulaire. Une activité altérée de CTNS perturbe le stockage lysosomal et les voies de protéostasie en aval, ce qui en fait un nœud clé pour l’étude du contrôle qualité des organites et de l’adaptation métabolique. CTNS est impliqué dans la dysfonction lysosomale liée à la cystinose et est fréquemment étudié dans des modèles de physiologie du tubule proximal rénal et de transport systémique des acides aminés.

Cystinosin Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CTNS sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Cystinosin Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CTNS dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CTNS, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Cystinosin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CTNS natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Cystinosin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Cystinosin dans les cellules tumorales présentant une expression de CTNS silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.