Plasmide CRISPR d'Activation (h2) CYP3A4: sc-416463-ACT-2

Le gène humain CYP3A4 code une mono-oxygénase majeure du cytochrome P450, localisée principalement au réticulum endoplasmique, qui catalyse le métabolisme oxydatif d’une grande diversité de xénobiotiques et de substrats endogènes, notamment des stéroïdes et des intermédiaires des acides biliaires. Son expression et son activité sont régulées par des voies de signalisation des récepteurs nucléaires telles que PXR (NR1I2) et CAR (NR1I3), reliant CYP3A4 aux programmes de détoxification hépatique, à l’homéostasie redox et aux mécanismes d’interactions médicamenteuses. La variabilité interindividuelle, due à des polymorphismes génétiques et à une transcription inductible, contribue à une capacité métabolique modifiée et a été associée, dans des études pharmacogénomiques, à une susceptibilité accrue aux effets indésirables médicamenteux et à des phénotypes hépatiques. L’édition génétique de CYP3A4 permet de construire des modèles cellulaires isogéniques afin d’examiner la fonction de l’enzyme, les éléments régulateurs et les réponses des réseaux métaboliques, et de quantifier les effets sur l’élimination des xénobiotiques et le métabolisme des stéroïdes dans des systèmes pertinents pour l’être humain.

CYP3A4 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CYP3A4 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CYP3A4 Le plasmide d'activation CRISPR (h2) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CYP3A4 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CYP3A4, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CYP3A4. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CYP3A4 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CYP3A4 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CYP3A4 dans les cellules tumorales présentant une expression de CYP3A4 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.