Plasmide CRISPR d'Activation (h) CYP27B1: sc-401155-ACT

CYP27B1 code pour la 25-hydroxyvitamine D 1α-hydroxylase mitochondriale, une enzyme du cytochrome P450 qui catalyse la conversion de la 25-hydroxyvitamine D en hormone active 1,25-dihydroxyvitamine D3. En contrôlant la production locale et systémique de calcitriol, CYP27B1 régule des programmes de signalisation du récepteur de la vitamine D liés à l’homéostasie du calcium et du phosphate, à la différenciation épithéliale et à la modulation immunitaire. L’activité de CYP27B1 intègre des voies métaboliques endocrines et paracrines, notamment l’activation rénale et extra-rénale de la vitamine D, et s’appuie sur des partenaires rédox mitochondriaux au sein du métabolisme des stéroïdes/de la vitamine D. Une dérégulation ou des variants perte de fonction de CYP27B1 sont associés à une activation insuffisante de la vitamine D et à des troubles héréditaires du métabolisme minéral, offrant un point d’entrée mécanistique pour étudier les réseaux transcriptionnels dépendants de la vitamine D dans des modèles cellulaires humains.

CYP27B1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CYP27B1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CYP27B1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CYP27B1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CYP27B1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CYP27B1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CYP27B1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CYP27B1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CYP27B1 dans les cellules tumorales présentant une expression de CYP27B1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.