CTPS1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403505-ACT

CTPS1 (CTP-Synthase 1) ist ein geschwindigkeitsbestimmendes Enzym der de-novo-Biosynthese von Cytidin-Nukleotiden, das die ATP-abhängige Umwandlung von UTP zu CTP katalysiert und dabei die Glutamin-Amidotransferase-Aktivität mit dem Pyrimidinstoffwechsel koppelt. Durch die Kontrolle intrazellulärer CTP-Pools unterstützt CTPS1 die DNA-/RNA-Synthese, die Phospholipidproduktion und proliferationsgekoppelte Stoffwechselprogramme und ist eng in die Nukleotidhomöostase sowie die Zellzyklusprogression integriert. Eine veränderte Regulation der Pyrimidinbiosynthese, einschließlich der CTPS1-Aktivität und der Assemblierung zu Cytoophidia-Filamenten, kann Replikationsstressantworten und die zelluläre Wachstumskapazität beeinflussen. Dysregulierter Nukleotidstoffwechsel wird häufig im Kontext maligner Transformation und der Aktivierung von Immunzellen untersucht, wodurch CTPS1 ein relevantes Ziel zur Untersuchung metabolischer Abhängigkeiten und der transkriptionellen Kontrolle der Proliferation darstellt.

CTPS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CTPS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CTPS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CTPS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CTPS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CTPS1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CTPS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CTPS1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CTPS1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CTPS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.