Plasmide CRISPR d'Activation (h) CST: sc-404388-ACT

SLC35A1 code le transporteur d’acide sialique lié au CMP (CST), un transporteur de sucres nucléotidiques localisé dans l’appareil de Golgi, qui importe le CMP–N‑acétylneuraminique du cytosol vers la lumière du Golgi afin de permettre la sialylation terminale des glycoprotéines et des glycolipides. En régulant la disponibilité de l’acide sialique activé pour les sialyltransférases, le CST influence le trafic des protéines, la stabilité des récepteurs, la reconnaissance cellule–cellule et les phénotypes d’interaction immunitaire via un contrôle global de la glycosylation. Une activité altérée de SLC35A1 peut remodeler les profils de sialylation à la surface cellulaire, avec des conséquences sur la signalisation, l’adhérence et les interactions avec les pathogènes, ce qui en fait une cible pertinente pour l’étude des troubles de la glycosylation et des mécanismes reliant le remodelage des glycannes au stress cellulaire et à des phénotypes associés aux maladies.

CST Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de SLC35A1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CST Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus SLC35A1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription SLC35A1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CST. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus SLC35A1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CST au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CST dans les cellules tumorales présentant une expression de SLC35A1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.