Plasmide CRISPR d'Activation (h) CRBP I: sc-402675-ACT

RBP1 code la protéine cellulaire de liaison au rétinol 1 (CRBP I), un transporteur cytosolique qui se lie au rétinol et en régule le trafic intracellulaire, le stockage et la conversion métabolique. En contrôlant l’acheminement du rétinol vers les rétinol déshydrogénases et la machinerie d’estérification en esters de rétinyle, CRBP I influence l’homéostasie des rétinoïdes ainsi que les programmes transcriptionnels dépendants de l’acide rétinoïque, qui façonnent la différenciation épithéliale, le développement et la régulation métabolique. Des altérations de l’expression de RBP1 ont été associées à une perturbation de la signalisation des rétinoïdes dans des contextes tels que la transformation épithéliale, la fibrose et la dysrégulation métabolique, ce qui en fait un nœud pertinent pour étudier la biologie de la vitamine A et le contrôle transcriptionnel. Dans les cellules humaines, CRBP I constitue un levier expérimental pratique pour analyser comment la disponibilité en rétinoïdes se couple aux voies des récepteurs nucléaires et aux transitions d’état cellulaire.

CRBP I Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de RBP1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CRBP I Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus RBP1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription RBP1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CRBP I. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus RBP1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CRBP I au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CRBP I dans les cellules tumorales présentant une expression de RBP1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.