CPS1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402014-ACT

Human CPS1 kodiert die Carbamoylphosphat-Synthase 1, ein mitochondriales Enzym, das den ersten festgelegten Schritt des Harnstoffzyklus katalysiert, indem es Ammoniak und Bicarbonat unter ATP-Verbrauch zu Carbamoylphosphat umsetzt. Diese Aktivität ist zentral für die hepatische Stickstoffentsorgung und steht in Wechselwirkung mit dem Aminosäureabbau, dem mitochondrialen Stoffwechsel und der nachgeschalteten Argininbiosynthese. Eine veränderte CPS1-Expression oder -Funktion wird mit Hyperammonämie und umfassenderen Stoffwechselentgleisungen in Verbindung gebracht; entsprechend wird der CPS1-Status häufig in Studien zur Leberphysiologie, zu mitochondrialen Stressantworten und zur Stickstoffbilanz untersucht. In der Krebs- und Stoffwechselforschung dient CPS1 zudem als kontextabhängiger Marker für metabolische Reprogrammierung und abstammungslinienassoziierte Harnstoffzyklusaktivität.

CPS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CPS1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CPS1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CPS1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CPS1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CPS1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CPS1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CPS1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CPS1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CPS1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.