COP1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402776-ACT

RFWD2 kodiert COP1, eine RING-Typ-E3-Ubiquitin-Ligase, die die Proteinstabilität reguliert, indem sie die Ubiquitinierung und den proteasomalen Abbau zahlreicher Signal- und Transkriptionsregulatoren katalysiert. COP1 beeinflusst zelluläre Programme wie DNA-Schadensantworten, Zellzyklusprogression und stressadaptive Transkription, indem es Menge und Aktivität von Effektoren in entsprechenden Signalwegen moduliert. Über seine Kontrolle der ubiquitinabhängigen Proteostase kann COP1 Transkriptionsnetzwerke umgestalten, die für onkogene Signalgebung, Differenzierung und zelluläre Homöostase relevant sind. Eine dysregulierte COP1-Expression oder -Aktivität wurde mit einem veränderten Gleichgewicht zwischen Tumorsuppressoren und Onkogenen in Verbindung gebracht, wodurch RFWD2 einen nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien zur krankheitsrelevanten Biologie ubiquitinweg-gekoppelter Prozesse darstellt.

COP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen RFWD2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

COP1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des RFWD2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der RFWD2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen COP1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native RFWD2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von COP1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des COP1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem RFWD2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.