COL4A2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-401462-ACT

COL4A2 kodiert die Alpha-2-Kette des Typ-IV-Kollagens, einen zentralen strukturellen Bestandteil von Basalmembranen, der sich zu Kollagen-IV-Netzwerken zusammensetzt und damit Gewebearchitektur sowie Filtrationsbarrieren stützt. Durch die Prägung der Organisation der extrazellulären Matrix und der Zell–Matrix-Adhäsion beeinflusst COL4A2 die Gefäßintegrität, die epitheliale Polarität und die Entwicklungs-Morphogenese und überschneidet sich mit Signalwegen wie Integrin/FAK-Signaling, ECM-Remodelling und der TGF-β–regulierten Matrixhomöostase. Störungen der Kollagen-IV-Zusammensetzung können die Mechanik und Permeabilität der Basalmembran verändern und so zu mikrovaskulären Funktionsstörungen und organspezifischer Pathologie beitragen. Genetische Varianten und Fehlregulationen von humanem COL4A2 wurden mit zerebrovaskulären und Small-Vessel-Erkrankungen, okulären Phänotypen sowie Anomalien der Nierenbasalmembran in Verbindung gebracht, wodurch es ein relevantes Ziel für die Untersuchung ECM-getriebener Krankheitsmechanismen darstellt.

COL4A2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen COL4A2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

COL4A2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des COL4A2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der COL4A2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen COL4A2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native COL4A2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von COL4A2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des COL4A2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem COL4A2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.