Plásmido CRISPR de Activación (h) CNPase: sc-402463-ACT

El CNP humano codifica la 2′,3′-nucleótido cíclico 3′-fosfodiesterasa (CNPasa), una enzima abundante asociada a la mielina que participa en la maduración de los oligodendrocitos, el mantenimiento de la vaina de mielina y la organización del citoesqueleto. La CNPasa hidroliza nucleótidos cíclicos 2′,3′ y participa en procesos asociados al ARN y en interacciones membrana–citoesqueleto que influyen en la extensión de las prolongaciones gliales y en el acoplamiento axón–glía. La alteración de la expresión o la actividad de CNP se ha vinculado a fenotipos de desmielinización y a contextos neuroinflamatorios, por lo que es relevante para estudios sobre la integridad de la sustancia blanca y la conectividad neural. Como marcador enriquecido en glía, la CNPasa se utiliza con frecuencia para investigar vías que regulan la mielinización, respuestas al estrés en oligodendrocitos y mecanismos subyacentes a la inestabilidad de la mielina.

CNPase El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de CNP sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

CNPase El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus CNP en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional CNP, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de CNPase. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo CNP y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de CNPase en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía CNPase en células tumorales con expresión de CNP silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.