CLC-KA CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404050-ACT

CLCNKA kodiert den Chloridkanal CLC-KA, ein in der Niere stark exprimiertes Mitglied der CLC-Familie, das zur basolateralen Cl⁻-Leitfähigkeit in Epithelien des distalen Nephrons beiträgt. Durch die Unterstützung des transepithelialen Salztransports und der elektrochemischen Kopplung an den Na⁺-Transport ist CLC-KA an Signalwegen beteiligt, die den renalen Elektrolythaushalt und die Homöostase des extrazellulären Flüssigkeitsvolumens steuern. Die Kanalaktivität ist funktionell mit akzessorischen Untereinheiten wie Barttin (BSND) verknüpft und in Transportprozesse im dicken aufsteigenden Teil der Henle-Schleife und im distalen Tubulus integriert. Genetische oder regulatorische Störungen von CLCNKA wurden mit Salzverlust-Phänotypen und Erkrankungen der renalen Chloridhandhabung in Verbindung gebracht, was das Gen für mechanistische Studien zu Tubulopathien und zur Regulation des Ionentransports relevant macht.

CLC-KA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CLCNKA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CLC-KA Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CLCNKA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CLCNKA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CLC-KA-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CLCNKA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CLC-KA-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CLC-KA-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CLCNKA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.