claudin-5 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400734-ACT

CLDN5 codifica a claudina-5, uma proteína tetraspan de junções oclusivas (tight junctions) altamente enriquecida em células endoteliais, onde ajuda a definir a seletividade da barreira paracelular e a manter a integridade vascular. A claudina-5 é um componente estrutural central das fitas de junções oclusivas e atua em cooperação com proteínas de ancoragem juncional e reguladores do citoesqueleto para coordenar a adesão célula–célula, a polaridade e a permeabilidade controlada nos leitos microvasculares. Alterações na expressão de CLDN5 ou na organização das junções estão associadas à disfunção da barreira hematoencefálica e a fenótipos de extravasamento vascular implicados em neuroinflamação, respostas a lesão isquêmica e angiogênese associada a tumores. Como resultado, CLDN5 é amplamente estudado em modelos de diferenciação endotelial, sinalização de barreira e homeostase vascular.

claudin-5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CLDN5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

claudin-5 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CLDN5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CLDN5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de claudin-5. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CLDN5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de claudin-5 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via claudin-5 em células tumorais com expressão de CLDN5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.