CHT1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404869-ACT

SLC5A7 kodiert den hochaffinen Cholintransporter 1 (CHT1), einen Solute-Carrier der Plasmamembran, der die natriumabhängige Aufnahme von Cholin vermittelt und damit den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Acetylcholinsynthese in cholinergen Neuronen darstellt. Indem CHT1 die intrazelluläre Verfügbarkeit von Cholin für die Cholinacetyltransferase steuert, verknüpft er Membrantransport mit dem Zyklus synaptischer Vesikel und einer anhaltenden cholinergen Neurotransmission. Eine veränderte SLC5A7-Aktivität wurde mit gestörter neuromuskulärer sowie zentraler cholinerger Signalübertragung in Verbindung gebracht und knüpft diesen Transporter an Signalwege, die für Motorik, kognitive Prozesse und autonome Regulation relevant sind. Als Determinante der präsynaptischen Acetylcholinproduktion wird CHT1 häufig in Modellen der neuronalen Differenzierung sowie in Systemen untersucht, die synaptische Transmission und die metabolische Kopplung an die Neurotransmittersynthese analysieren.

CHT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SLC5A7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CHT1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SLC5A7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SLC5A7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CHT1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SLC5A7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CHT1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CHT1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SLC5A7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.