Plasmide CRISPR d'Activation (h) Chk2: sc-400438-ACT

CHEK2 code pour la kinase humaine de point de contrôle Chk2, une kinase sérine/thréonine activée en aval d’ATM en réponse aux cassures double brin de l’ADN. Chk2 propage le signal de dommage à l’ADN en phosphorylant des effecteurs qui régulent les points de contrôle du cycle cellulaire, la réparation de l’ADN, l’apoptose et les réponses au stress de réplication, en s’intégrant à p53 et à d’autres réseaux de surveillance du génome. Par ces voies, CHEK2 contribue à préserver la stabilité génomique et influence le devenir cellulaire après un stress génotoxique. Une signalisation CHEK2/Chk2 altérée est associée à un contrôle défectueux des points de contrôle et à une susceptibilité accrue à l’instabilité du génome observée dans de multiples contextes pathologiques, ce qui étaye sa large pertinence pour les études mécanistiques.

Chk2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de CHEK2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Chk2 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus CHEK2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription CHEK2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Chk2. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus CHEK2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Chk2 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Chk2 dans les cellules tumorales présentant une expression de CHEK2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.