Plasmide CRISPR d'Activation (h) Che-1: sc-404982-ACT

L’AATF humain code Che-1, un cofacteur transcriptionnel nucléaire impliqué dans la coordination de la progression du cycle cellulaire, de la signalisation des dommages à l’ADN et des seuils apoptotiques. Che-1 interagit avec les complexes de régulation de la transcription et de la chromatine afin de moduler des programmes d’expression liés aux réponses au stress dépendantes de p53 et à la transcription médiée par l’ARN polymérase II. Par ces fonctions, AATF contribue aux décisions cellulaires entre prolifération et arrêt au point de contrôle, et sa dérégulation a été associée à une altération des signaux de survie et à des phénotypes d’instabilité génomique dans des contextes pertinents pour le cancer. L’activité de Che-1 est également étudiée en lien avec la protéostasie et le métabolisme de l’ARN, ce qui soutient son utilisation dans des investigations mécanistiques des voies d’adaptation au stress.

Che-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AATF sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Che-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AATF dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AATF, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Che-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AATF natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Che-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Che-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de AATF silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.