Plasmide CRISPR d'Activation (m) CDKN2A/p16: sc-419610-ACT

Le gène murin *Cdkn2a* code le suppresseur de tumeur CDKN2A/p16, un inhibiteur des kinases dépendantes des cyclines qui freine l’activité de CDK4/6 afin de maintenir RB1 à l’état hypophosphorylé et d’imposer le point de contrôle G1/S. En limitant la transcription dépendante d’E2F, p16 intègre les signaux prolifératifs aux programmes d’arrêt du cycle cellulaire et est fréquemment mobilisé lors de la sénescence réplicative et des réponses au stress induit par des oncogènes. La dérégulation du locus *Cdkn2a* est étroitement associée à une prolifération aberrante et à des états de sénescence altérés, ce qui en fait un nœud central des études portant sur le contrôle du cycle cellulaire, les phénotypes liés au vieillissement et la biologie du cancer dans les modèles murins.

CDKN2A/p16 Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Cdkn2a sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CDKN2A/p16 Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Cdkn2a dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Cdkn2a, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CDKN2A/p16. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Cdkn2a natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CDKN2A/p16 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CDKN2A/p16 dans les cellules tumorales présentant une expression de Cdkn2a silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.