Cdc6 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400796-ACT

CDC6 kodiert die humane Cdc6-ATPase, einen essenziellen Licensing-Faktor der DNA-Replikation, der in der G1-Phase mit ORC und CDT1 zusammenwirkt, um die MCM2–7-Helikase an Replikationsursprüngen zu laden. Durch die Koordination dieses Origin-Licensing trägt Cdc6 dazu bei, dass die Replikation nur einmal pro Zellzyklus erfolgt, und ist mit der Kontrolle des S-Phasen-Eintritts, der Signalgebung bei Replikationsstress sowie Checkpoint-Signalwegen einschließlich ATR/CHK1 verknüpft. Eine fehlregulierte CDC6-Expression kann abnormes Origin-Firing, genomische Instabilität und veränderte Zellzyklusdynamiken fördern – Merkmale, die häufig in der Tumorbiologie und anderen proliferationsassoziierten Pathologien beobachtet werden. Als zentraler Bestandteil der Initiationsmaschinerie der Replikation wird CDC6 oft im Zusammenhang mit DNA-Schadensantworten, onkogeninduziertem Replikationsstress und Mechanismen untersucht, die das Replikations-Licensing an den Chromatinzustand koppeln.

Cdc6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CDC6-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

Cdc6 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CDC6-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CDC6-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen Cdc6-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CDC6-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von Cdc6-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des Cdc6-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CDC6-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.