CD8-α CRISPR Activation Plasmid (h): sc-400372-ACT

CD8A kodiert CD8-α, ein Typ‑I‑transmembranöses Glykoprotein, das auf zytotoxischen T‑Lymphozyten und Subpopulationen angeboren‑ähnlicher T‑Zellen entweder CD8αα‑Homodimere oder CD8αβ‑Heterodimere bildet. CD8‑α fungiert als Korezeptor für MHC‑Klasse‑I‑restriktierte TCR‑Signalübertragung, indem es an MHC I bindet und LCK an den CD3‑Komplex rekrutiert. Dadurch verstärkt es die antigenabhängige Aktivierung, die zytolytische Differenzierung und die Zytokinproduktion. Über diese Rolle ist CD8A mit Signalwegen verknüpft, die die Bildung der immunologischen Synapse, die Effektorprogrammierung von T‑Zellen und interferongetriebene Entzündungsreaktionen steuern. Eine veränderte CD8A‑Expression und CD8+‑T‑Zell‑Zustände werden häufig als Indikatoren für Immuninfiltration und Dysfunktion bei chronischen Infektionen, Autoimmunität und tumorassoziierter Immunmodulation verwendet.

CD8-α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen CD8A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CD8-α Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des CD8A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der CD8A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CD8-α-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native CD8A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CD8-α-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CD8-α-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem CD8A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.