Plasmide CRISPR d'Activation (h) CD42d: sc-404793-ACT

GP5 code la glycoprotéine plaquettaire V (CD42d), un composant du complexe récepteur GPIb-IX-V, qui régule l’adhésion et l’activation des plaquettes en conditions de forte contrainte de cisaillement. Par ses interactions avec le facteur von Willebrand et la signalisation dépendante de la thrombine, CD42d contribue à l’hémostase primaire, au remodelage du cytosquelette et à l’activation des intégrines qui soutiennent la formation du thrombus. Une altération de l’abondance ou de la fonction du complexe GPIb-IX-V est associée à des phénotypes de dysfonction plaquettaire ainsi qu’à une prédisposition hémorragique ou thrombotique, ce qui fait de GP5 un nœud pertinent dans les études de biologie vasculaire et de coagulation. Dans les systèmes expérimentaux, l’expression de GP5 peut également servir de marqueur des programmes de lignée mégacaryocytaire/plaquettaire et de l’assemblage du complexe récepteur.

CD42d Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de GP5 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

CD42d Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus GP5 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription GP5, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de CD42d. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus GP5 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de CD42d au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie CD42d dans les cellules tumorales présentant une expression de GP5 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.