CCDC23 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-415702-ACT

SVBP kodiert CCDC23, ein Protein mit Coiled-Coil-Domäne, das an zentrosomenassoziierten Prozessen und der Organisation von Mikrotubuli beteiligt ist und dem Funktionen bei der Regulation der mitotischen Spindel sowie der Chromosomentrennung zugeschrieben werden. Über diese Funktionen kann CCDC23 den Zellzyklus und Signalwege zur Aufrechterhaltung der Genomstabilität beeinflussen, die in proliferativen Krankheitskontexten häufig gestört sind. Eine veränderte Expression oder Fehlregulation zentrosomaler und spindelassoziierter Faktoren ist oft mit Aneuploidie und zellulären Stressantworten verknüpft, was SVBP/CCDC23 für mechanistische Studien in der Krebsbiologie und verwandten Modellen relevant macht. Seine intrazelluläre Lokalisation und die vorhergesagten Scaffold-Eigenschaften sprechen zudem dafür, es als Ansatzpunkt zu nutzen, um Protein-Interaktionsnetzwerke zu untersuchen, die Mitose und Zytoskelettdynamik steuern.

CCDC23 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen SVBP-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

CCDC23 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des SVBP-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der SVBP-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen CCDC23-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native SVBP-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von CCDC23-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des CCDC23-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem SVBP-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.