Plásmido CRISPR de Activación (m) cathepsin S: sc-419881-ACT

El gen Ctss de ratón codifica la catepsina S, una proteasa cisteínica lisosomal que permanece activa a un pH casi neutro y favorece el procesamiento de antígenos mediante la degradación de la cadena invariante, lo que facilita la carga de péptidos en el MHC de clase II. Contribuye al recambio de proteínas endolisosomales, a la remodelación de la matriz extracelular y a la regulación de la señalización inflamatoria en células presentadoras de antígeno, incluidas macrófagos y células dendríticas. La actividad de Ctss se cruza con vías inmunitarias que modulan la activación de la inmunidad adaptativa y puede influir en la remodelación tisular dentro de microambientes inflamatorios. La expresión o actividad desregulada de la catepsina S se ha asociado con fenotipos autoinmunes e inflamatorios, y se estudia con frecuencia en modelos de neuroinflamación, aterosclerosis e inmunidad asociada a tumores.

cathepsin S El plásmido de activación CRISPR (m) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de Ctss sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

cathepsin S El plásmido de activación CRISPR (m) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus Ctss en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional Ctss, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de cathepsin S. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo Ctss y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de cathepsin S en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía cathepsin S en células tumorales con expresión de Ctss silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.