calsequestrin 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403375-ACT

CASQ1 codifica a calsequestrina 1, uma proteína de alta capacidade de ligação a Ca2+ localizada no lúmen do retículo sarcoplasmático em músculo esquelético de contração rápida. Ao tamponar e liberar Ca2+ luminal, a calsequestrina 1 dá suporte ao acoplamento excitação–contração e ajuda a modular a dinâmica de liberação de Ca2+ mediada pelo receptor de rianodina, influenciando a homeostase do cálcio, a contratilidade muscular e a estabilidade dos estoques de Ca2+ no RS. Alterações na função de CASQ1 têm sido associadas a sinalização intracelular de Ca2+ alterada e a respostas ao estresse no músculo esquelético, oferecendo um ponto de entrada mecanístico para estudar vias dependentes de Ca2+, proteostase e fisiologia das fibras musculares. Como regulador central do tamponamento de Ca2+ no RS, CASQ1 é frequentemente investigado em modelos de disfunção muscular nos quais o manuseio anormal de Ca2+ contribui para a patologia.

calsequestrin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CASQ1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

calsequestrin 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CASQ1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CASQ1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de calsequestrin 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CASQ1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de calsequestrin 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via calsequestrin 1 em células tumorais com expressão de CASQ1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.