C4a CRISPR Activation Plasmid (h): sc-402428-ACT

Humanes C4A kodiert die Komplementkomponente C4, einen zentralen Effektor der klassischen und der Lektin-Komplementkaskade, der die Immunüberwachung durch Opsonisierung und die Verstärkung entzündlicher Signalweiterleitung erhöht. Die proteolytische Prozessierung von C4 trägt zur Bildung von Aktivierungsfragmenten bei, die Interaktionen mit Komplementrezeptoren und anderen Mediatoren der angeborenen Immunität koordinieren und dadurch die Beseitigung von Immunkomplexen und zellulären Trümmern beeinflussen. Unterschiede in Gen-Dosis oder Expression von C4A wurden mit veränderter Komplementaktivität in Verbindung gebracht und sind mit Immunfehlregulation assoziiert, einschließlich einer erhöhten Anfälligkeit für autoimmune Phänotypen und neuroinflammatorische Prozesse. Als funktioneller Knotenpunkt innerhalb der Komplementkaskade wird C4A häufig in Modellen der Wirtsabwehr, Gewebeentzündung sowie des synaptischen oder myelinassoziierten Umbaus untersucht.

C4a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen C4A-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

C4a Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des C4A-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der C4A-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen C4a-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native C4A-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von C4a-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des C4a-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem C4A-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.