BORIS Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-437064-ACT

Mouse Ctcfl codifica BORIS (Brother of the Regulator of Imprinted Sites), un paralogo di CTCF arricchito nel testicolo che si lega a elementi di DNA simili agli insulator e partecipa all’organizzazione della cromatina e alla regolazione trascrizionale. BORIS può influenzare lo stato epigenetico interagendo con regioni regolatorie sensibili alla metilazione del DNA e modulando la comunicazione tra enhancer e promotore, influenzando così programmi di espressione genica legati allo sviluppo delle cellule germinali e all’identità cellulare. Un’espressione aberrante di BORIS è stata associata alla derepressione di loci normalmente silenziati, a un’alterata accessibilità della cromatina e a un rimaneggiamento trascrizionale osservato in contesti oncogenici. Queste caratteristiche rendono Ctcfl un modello utile per studiare l’architettura del genoma, la regolazione legata all’imprinting e i meccanismi di disregolazione epigenetica nei sistemi murini.

BORIS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ctcfl senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

BORIS Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ctcfl nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ctcfl, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di BORIS. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ctcfl nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da BORIS nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via BORIS nelle cellule tumorali con espressione di Ctcfl silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.