BMP-7 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419346-ACT

Bone Morphogenetic Protein 7 (Bmp7) kodiert BMP-7, einen sezernierten Liganden der TGF-β-Superfamilie, der über Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren vom Typ I/II signalisiert, um SMAD1/5/8 sowie nachgeschaltete Transkriptionsprogramme zu aktivieren. In Mauszellen reguliert BMP-7 die embryonale Musterbildung, die Skelettentwicklung, die renale Morphogenese und die epitheliale Differenzierung, wobei es je nach Kontext zu einem Crosstalk mit MAPK-Signalwegen kommt. BMP-7 beeinflusst zudem den Umbau der extrazellulären Matrix und die epithelial–mesenchymale Transition, Prozesse, die häufig in der Fibroseforschung und in Modellen der Gewebereparatur untersucht werden. Eine dysregulierte BMP-7-Signalgebung wurde mit Entwicklungsstörungen und einer veränderten Organhomöostase in Verbindung gebracht, was BMP-7 zu einem nützlichen Knotenpunkt für die Analyse von Signalwegen in krankheitsrelevanten Systemen macht.

BMP-7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Bmp7-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

BMP-7 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Bmp7-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Bmp7-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen BMP-7-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Bmp7-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von BMP-7-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des BMP-7-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Bmp7-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.