beta Tubulin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400044-ACT

O gene humano TUBB codifica a beta-tubulina, uma subunidade estrutural central dos microtúbulos que polimeriza com a alfa-tubulina para formar o fuso mitótico e manter a arquitetura do citoesqueleto. A dinâmica da beta-tubulina sustenta a segregação cromossômica, o transporte intracelular por meio dos motores cinesina e dineína, a polaridade celular e processos relacionados aos cílios, através do remodelamento contínuo dos microtúbulos. A atividade de TUBB se cruza com a regulação do ciclo celular e com a sinalização dependente de microtúbulos que molda a proliferação e a migração. Alterações na expressão de tubulina ou no comportamento dos microtúbulos são amplamente relevantes para estudos de instabilidade cromossômica, mecanismos do neurodesenvolvimento e de neurodegeneração, e mudanças dirigidas pelo citoesqueleto observadas na biologia de células cancerosas.

beta Tubulin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de TUBB sem alterar a sequência de ADN subjacente.

beta Tubulin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus TUBB em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição TUBB, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de beta Tubulin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus TUBB nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de beta Tubulin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via beta Tubulin em células tumorais com expressão de TUBB silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.