Plasmide CRISPR d'Activation (m) beta-catenin: sc-419477-ACT

Ctnnb1 code la bêta-caténine, une protéine multifonctionnelle à répétitions armadillo qui relie les jonctions d’adhérence dépendantes des cadhérines au cytosquelette d’actine et sert de coactivateur transcriptionnel central dans la signalisation Wnt canonique. Lors de l’activation de la voie Wnt, la bêta-caténine stabilisée s’accumule dans le noyau et s’associe aux facteurs TCF/LEF pour réguler des programmes géniques contrôlant la prolifération, la différenciation, les dynamiques épithélio-mésenchymateuses et le maintien des cellules souches. La régulation fine du renouvellement de la bêta-caténine par le complexe de dégradation APC/AXIN/GSK3β est essentielle à l’homéostasie tissulaire, et la perturbation de cet axe est fortement associée à une signalisation oncogénique. Dans des modèles murins, la perturbation de Ctnnb1 est largement utilisée pour étudier le développement, la régénération et des réseaux de signalisation pertinents pour les maladies dans l’intestin, le foie, la peau, l’os et les compartiments immunitaires.

beta-catenin Le plasmide d'activation CRISPR (m) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de Ctnnb1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

beta-catenin Le plasmide d'activation CRISPR (m) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus Ctnnb1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription Ctnnb1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de beta-catenin. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus Ctnnb1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de beta-catenin au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie beta-catenin dans les cellules tumorales présentant une expression de Ctnnb1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.