Plasmide CRISPR d'Activation (h) BECN1/Beclin-1: sc-400139-ACT

BECN1 code la bécline-1, un échafaudage central des complexes de phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PI3KC3/VPS34) qui initient la nucléation des autophagosomes et régulent le trafic endosomal. Par ses interactions avec ATG14, UVRAG et des protéines de la famille BCL2, la bécline-1 intègre la détection des nutriments et les signaux de stress afin de contrôler le flux autophagique, le contrôle qualité des organites et les réponses immunitaires innées. Une activité altérée de BECN1 a été associée à une protéostasie et une inflammation déréglées dans des modèles de biologie du cancer, de neurodégénérescence et de maladies infectieuses. En tant que régulateur nodal de l’autophagie, la bécline-1 est largement utilisée pour étudier les interactions entre l’autophagie, l’apoptose et les voies de signalisation médiées par les vésicules.

BECN1/Beclin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de BECN1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

BECN1/Beclin-1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus BECN1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription BECN1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de BECN1/Beclin-1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus BECN1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de BECN1/Beclin-1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie BECN1/Beclin-1 dans les cellules tumorales présentant une expression de BECN1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.