ATF4 CRISPR Activation Plasmid (m): sc-419228-ACT

Mouse Atf4 kodiert den aktivierenden Transkriptionsfaktor 4 (ATF4), einen stressresponsiven bZIP-Transkriptionsfaktor, der Signale aus der integrierten Stressantwort und der Antwort auf fehlgefaltete Proteine (Unfolded Protein Response, UPR) zusammenführt, um Genexpressionsprogramme neu zu gestalten. ATF4 wird nachgeschaltet der Phosphorylierung von eIF2α induziert und koordiniert den Aminosäurestoffwechsel, die Redox- und Glutathion-Homöostase, Autophagie sowie adaptive Überlebenswege bei Nährstoffmangel, ER-Stress und Hypoxie. Über Crosstalk mit PERK–eIF2α-, mTOR- und oxidativem Stress-Signaling beeinflusst ATF4 die zelluläre Differenzierung und die mitochondriale Funktion in mehreren Geweben. Eine dysregulierte ATF4-Aktivität wurde mit pathologischer Stressanpassung sowie inflammatorischen und metabolischen Phänotypen in Verbindung gebracht, was ATF4 zu einem nützlichen Knotenpunkt für mechanistische Studien der Proteostase und stressassoziierter Krankheitsmodelle in Mäusen macht.

ATF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen Atf4-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ATF4 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (m) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des Atf4-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der Atf4-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ATF4-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native Atf4-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ATF4-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ATF4-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem Atf4-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.