ASAHL CRISPR Activation Plasmid (h): sc-407543-ACT

Das humane NAAA-Gen kodiert die N-Acylethanolamin-Säureamidase (ASAHL), ein lysosomales Enzym, das Fettsäureethanolamide wie Palmitoylethanolamid zu den entsprechenden Fettsäuren und Ethanolamin hydrolysiert. Durch die Kontrolle intrazellulärer Pools bioaktiver N-Acylethanolamine beeinflusst ASAHL Lipid-Signalnetzwerke, die mit der Regulation von Entzündungen, zellulären Stressantworten und der Funktion von Immunzellen verknüpft sind. Die Aktivität von NAAA/ASAHL wird häufig im Kontext von Neuroinflammation, Schmerzbiologie und metabolischer Inflammation untersucht, da eine veränderte Umsetzung von Lipidmediatoren den Tonus von Signalwegen verschieben kann, ohne die vorgelagerte Biosynthese zu verändern. Seine lysosomenassoziierte Rolle macht es zudem relevant für die Untersuchung von Organellenhomöostase und Lipidkatabolismus in krankheitsrelevanten Zellmodellen.

ASAHL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen NAAA-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ASAHL Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des NAAA-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der NAAA-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ASAHL-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native NAAA-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ASAHL-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ASAHL-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem NAAA-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.