Plásmido CRISPR de Activación (h) ARAP3: sc-405365-ACT

ARAP3 (también conocido como CENTD3) codifica una ArfGAP y RhoGAP de unión a fosfoinosítidos que acopla la señalización de PI3K con la regulación coordinada de las GTPasas ARF6 y de la familia Rho. Gracias a su arquitectura multidominio, ARAP3 modula la remodelación del citoesqueleto de actina, el tráfico de membranas, la adhesión dependiente de integrinas y las respuestas quimiotácticas, en particular en linajes endoteliales y hematopoyéticos. La actividad de ARAP3 se integra con vías que controlan la migración celular, la morfogénesis vascular y la señalización inflamatoria, lo que la hace relevante para estudios de angiogénesis y del tráfico de leucocitos. La desregulación de la señalización de pequeñas GTPasas y los cambios en la expresión de ARAP3 se han asociado con la invasión de células cancerosas y la remodelación del microambiente tumoral, lo que respalda su uso como un nodo para investigar mecanismos de vías de señalización.

ARAP3 El plásmido de activación CRISPR (h) proporciona un enfoque específico y no destructivo para regular al alza la expresión endógena de ARAP3 sin alterar la secuencia de ADN subyacente.

ARAP3 El plásmido de activación CRISPR (h) es un sistema mediador de activación sinérgica (SAM) de tres plásmidos diseñado para la regulación al alza transcripcional altamente eficiente y específica del locus ARAP3 en líneas celulares humanas. El sistema se basa en una Cas9 catalíticamente inactiva (dCas9) que porta dos mutaciones inactivadoras (D10A y N863A) que eliminan la actividad nucleasa al tiempo que conservan la unión al ADN. Esta dCas9 se fusiona con VP64, un potente activador transcripcional, y se coexpresa con un gen de resistencia a la blasticidina para la selección. El segundo plásmido codifica la proteína de fusión MS2-p65-HSF1, un complejo activador secundario que actúa en conjunto con dCas9-VP64, junto con un gen de resistencia a la higromicina. El tercer plásmido codifica un ARN guía (sgRNA) específico del objetivo de 20 nt fusionado a dos aptámeros de ARN MS2 que reclutan el complejo MS2-p65-HSF1 al sitio de activación, acompañado de un gen de resistencia a la puromicina. Los tres plásmidos se administran en una proporción de masa de 1:1:1 para una expresión equilibrada de todos los componentes del sistema.

Una vez ensamblado en el locus diana, el complejo SAM se une aproximadamente 200 pb aguas arriba del sitio de inicio transcripcional ARAP3, donde VP64, p65 y HSF1 actúan de forma coordinada para reclutar la maquinaria transcripcional e impulsar la regulación al alza de la expresión endógena de ARAP3. A diferencia de la Cas9 con actividad nucleasa, dCas9 no introduce roturas de doble cadena ni modifica la secuencia genómica, preservando el locus nativo ARAP3 y permitiendo el estudio de las respuestas transcripcionales dependientes de ARAP3 en el locus endógeno, lo que la convierte en una herramienta valiosa para estudios funcionales, la identificación de genes diana y la modelización de la restauración de la vía ARAP3 en células tumorales con expresión de ARAP3 silenciada o reducida.

Sólo para uso en investigación. No destinado a uso diagnóstico o terapéutico.