Plasmide CRISPR d'Activation (h) APPL1: sc-402243-ACT

APPL1 (protéine adaptatrice, interagissant avec les phosphotyrosines via un domaine PH et un motif « leucine zipper » 1) est une protéine adaptatrice cytosolique des endosomes qui relie le trafic membranaire à la transduction du signal en aval de récepteurs tels que les récepteurs de l’adiponectine et les voies de l’insuline/IGF. En se liant à Rab5 et aux phosphoinositides et en mobilisant les voies de signalisation AKT et AMPK, APPL1 module la dynamique endosomale, l’homéostasie du glucose et les réponses cellulaires aux signaux métaboliques. La signalisation dépendante d’APPL1 influence la prolifération, la survie et les réponses au stress oxydant via PI3K–AKT et des réseaux apparentés. Des altérations de l’expression ou de la fonction d’APPL1 ont été associées à la résistance à l’insuline et à des phénotypes de syndrome métabolique, et APPL1 est fréquemment étudiée dans des contextes reliant l’endocytose à la signalisation oncogénique et cardiométabolique.

APPL1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de APPL1 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

APPL1 Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus APPL1 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription APPL1, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de APPL1. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus APPL1 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de APPL1 au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie APPL1 dans les cellules tumorales présentant une expression de APPL1 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.