AOX1 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-403997-ACT

Das menschliche AOX1 kodiert die Aldehdoxidase 1, ein molybdänabhängiges zytosolisches Enzym, das im Rahmen der Xenobiotika-Metabolisierung der Phase I die Oxidation verschiedener Aldehyde und N‑heterozyklischer Verbindungen katalysiert. AOX1 trägt zur Redoxhomöostase bei und ist in übergeordnete Stoffwechselnetzwerke eingebunden, indem es als Nebenprodukte reaktive Sauerstoffspezies erzeugt und zur Eliminierung endogener Aldehyde beiträgt, die bei der Lipidperoxidation entstehen. Veränderungen in der AOX1-Expression oder -Aktivität können die zelluläre Empfindlichkeit gegenüber oxidativem Stress verändern und metabolische Phänotypen beeinflussen, was AOX1 für Studien zur Leberfunktion und Entgiftungskapazität relevant macht. Eine fehlregulierte Aldehydverarbeitung wurde mit entzündlichen und fibrotischen Prozessen in Verbindung gebracht, was die Untersuchung von AOX1 als modifizierenden Faktor in Modellen metabolischer und oxidativer Schädigung unterstützt.

AOX1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen AOX1-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

AOX1 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des AOX1-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der AOX1-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen AOX1-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native AOX1-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von AOX1-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des AOX1-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem AOX1-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.