ANO2 CRISPR Activation Plasmid (h): sc-404198-ACT

Humanes ANO2 (Anoctamin 2/TMEM16B) kodiert einen calciumaktivierten Chloridkanal, der die Membran-Erregbarkeit und die Ionenhomöostase in elektrisch erregbaren Zellen reguliert. Die ANO2-Aktivität koppelt intrazelluläre Ca2+-Signale an den Chloridfluss und formt dadurch reizinduzierte Depolarisationen, Nachpotenziale und Signalanpassung, insbesondere in sensorischen und neuronalen Kontexten. Über diese Prozesse trägt ANO2 zu Ca2+-abhängigen Signalnetzwerken bei, die Neurotransmission, sensorische Transduktion und aktivitätsabhängige zelluläre Antworten beeinflussen. Veränderte Chloridleitfähigkeit der Anoctamin-Familie wurde mit dysregulierter Erregbarkeit und sensorischen Funktionsstörungen in Verbindung gebracht, was ANO2 zu einem relevanten Ziel für mechanistische Studien der Kanalbiologie und Ca2+-gekoppelten Signalgebung macht.

ANO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) bietet einen gezielten, nicht-destruktiven Ansatz zur Hochregulierung der endogenen ANO2-Expression, ohne die zugrunde liegende DNA-Sequenz zu verändern.

ANO2 Das CRISPR-Aktivierungsplasmid (h) ist ein aus drei Plasmiden bestehendes synergistisches Aktivierungsmediator-System (SAM), das für eine hocheffiziente, ortsspezifische transkriptionelle Hochregulation des ANO2-Lokus in menschlichen Zelllinien entwickelt wurde. Das System basiert auf einem katalytisch inaktiven Cas9 (dCas9), das zwei inaktivierende Mutationen (D10A und N863A) trägt, welche die Nukleaseaktivität eliminieren, während die DNA-Bindung erhalten bleibt. Dieses dCas9 ist mit VP64, einem potenten Transkriptionsaktivator, fusioniert und wird zusammen mit einem Blasticidin-Resistenzgen zur Selektion koexprimiert. Das zweite Plasmid kodiert das MS2-p65-HSF1-Fusionsprotein, einen sekundären Aktivatorkomplex, der zusammen mit dCas9-VP64 wirkt, sowie ein Hygromycin-Resistenzgen. Das dritte Plasmid kodiert für eine zielspezifische 20-nt-sgRNA, die an zwei MS2-RNA-Aptamere fusioniert ist, welche den MS2-p65-HSF1-Komplex an die Aktivierungsstelle rekrutieren, begleitet von einem Puromycin-Resistenzgen. Die drei Plasmide werden im Massenverhältnis 1:1:1 verabreicht, um eine ausgewogene Expression aller Systemkomponenten zu gewährleisten.

Nach der Assemblierung am Zielort bindet der SAM-Komplex etwa 200 bp stromaufwärts der ANO2-Transkriptionsstartstelle, wo VP64, p65 und HSF1 gemeinsam die Transkriptionsmaschinerie rekrutieren und die Hochregulation der endogenen ANO2-Expression vorantreiben. Im Gegensatz zu nukleaseaktivem Cas9 verursacht dCas9 keine Doppelstrangbrüche und verändert die genomische Sequenz nicht, wodurch der native ANO2-Locus erhalten bleibt und die Untersuchung von ANO2-abhängigen Transkriptionsreaktionen am endogenen Locus ermöglicht wird. Dies macht es zu einem wertvollen Werkzeug für Funktionsstudien, die Identifizierung von Zielgenen und die Modellierung der Wiederherstellung des ANO2-Signalwegs in Tumorzellen mit stillgelegtem oder reduziertem ANO2-Ausdruck.

Nur für Forschungszwecke. Nicht für diagnostische oder therapeutische Zwecke bestimmt.