Plasmide CRISPR d'Activation (h) Amylase: sc-400533-ACT

AMY2A code une α-amylase pancréatique sécrétée qui initie la digestion des glucides en hydrolysant les liaisons glycosidiques α-1,4 de l’amidon et du glycogène alimentaires, afin de produire du maltose et des oligosaccharides. Son expression et sa sécrétion sont étroitement liées à la différenciation du pancréas exocrine et à la biologie de la voie sécrétoire régulée, en intégrant des programmes transcriptionnels sensibles aux nutriments au trafic des granules de zymogènes. Une production d’amylase altérée est couramment utilisée comme lecture fonctionnelle de l’état des cellules acineuses pancréatiques et de l’homéostasie des enzymes digestives, et AMY2A est étudié dans des contextes où la fonction exocrine est perturbée, notamment lors d’inflammation pancréatique et de dérégulations plus larges des enzymes digestives. En tant qu’enzyme sécrétée fortement exprimée, AMY2A sert également de locus modèle pour l’étude du contrôle transcriptionnel des protéines sécrétées et de l’identité des cellules acineuses.

Amylase 2a Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de AMY2A sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Amylase 2a Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus AMY2A dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription AMY2A, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Amylase 2a. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus AMY2A natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Amylase 2a au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Amylase 2a dans les cellules tumorales présentant une expression de AMY2A silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.