ALP Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-401877-ACT

PDLIM3 codifica a ALP (proteína LIM associada à actinina), um andaime da família PDZ-LIM que se localiza no disco Z do músculo estriado e conecta a organização do citoesqueleto à sinalização. Ao se ligar à α-actinina e a complexos associados à actina, a ALP ajuda a coordenar a montagem do sarcômero, a mecanotransdução e programas de controle de qualidade proteica que mantêm a integridade miofibrilar. Perturbações na rede associada ao PDLIM3 têm sido relacionadas a alterações na estrutura e na função do músculo cardíaco e esquelético, sustentando sua investigação em vias relevantes para cardiomiopatias e miopatias. Em modelos celulares e teciduais, a modulação da expressão de ALP é comumente usada para estudar respostas ao estresse, remodelamento do citoesqueleto e estados de diferenciação muscular.

ALP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de PDLIM3 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

ALP O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus PDLIM3 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição PDLIM3, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de ALP. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus PDLIM3 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de ALP no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via ALP em células tumorais com expressão de PDLIM3 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.